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- 透射电子显微镜-
什么是透射电子显微镜?
透射电子显微镜(TEM)是一种用于观察物质中最小结构的分析技术。与依赖可见光光谱的光学显微镜不同，透射电镜可以将纳米结构放大到5000万倍，从而揭示原子尺度上令人惊叹的细节。这是因为当电子在强电磁场中加速时，其波长比可见光的波长短得多(约为可见光的10万倍)，从而将显微镜分辨率提高了几个数量级。
为了形成TEM图像，高能电子束通过极薄的“电子透明”样品(通常薄于100纳米)进行加速。一系列的电磁透镜和光圈被放置在整个显微镜的柱上，将光束聚焦在样品上，最大限度地减少失真，并将产生的图像放大到荧光屏或专用相机上。
TEM还是STEM?
看看这个简短的视频，看看这两种不同的成像模式是如何创建原子分辨率的图像的!
TEM有许多不同的形式，但都具有相同的基本原理和组件。TEM仪器的两种主要类型是传统的TEM(也简称为TEM)和STEM(扫描透射电子显微镜)。TEM的其他变体包括AC- s /TEM(其中AC代表“畸变校正”)和E- s /TEM(其中E代表“环境”)。
自20世纪30年代初首次展示电子光学以来，近一个世纪的研究和发展已达到顶峰，使TEM成为材料和生命科学应用中不可或缺的技术。最强大的现代tem配备了改进和额外的探测器，不仅提高了显微镜的性能和稳定性，而且提供了从广泛的材料中收集亚纳米长度尺度的化学和电子信息的额外能力。
透射电镜的用途是什么?
将瞬变电磁法应用于我们周围的世界，推动了无数的发现和创新。“看到”原子的能力使科学家能够在最基本的层面上理解材料和生物系统。TEM图像不仅具有巨大的科学价值，而且本身就是一种艺术形式。
材料科学与纳米技术TEM
放大到原子尺度，科学家可以看到功能材料的基本组成部分，如催化剂纳米颗粒、电池和半导体器件。聚焦电子束也可用于原位操纵材料，使“纳米制造”和新现象得以研究和发现。这种尺度上的细节水平令人惊叹，并为理解结构、性能和性能之间的联系提供了一种方法，允许工程师从下往上设计纳米材料。
生命科学TEM
生物学的世界充满了迷人的和动态的，但看不见的现象。低温透射电镜使结构生物学家能够以接近原子的分辨率可视化大分子组件的结构，如蛋白质、病毒和细胞内结构。最近的技术进步，如直接电子探测器的使用、自动化和数据处理，已推动该技术成为主流。通过一种被称为单颗粒分析的方法，科学家们已经能够确定新型冠状病毒刺突蛋白的结构，这种蛋白质可以使病毒与宿主细胞结合，从而开发出靶向疫苗。
通过使用Vitrojet[9]制备的玻璃化样品进行低温电镜分析生成的载铁蛋白颗粒的透射电镜显微照片和3D重建，计算分辨率为2.5 Å。
透射电子显微镜的组成
专业训练课程由五个主要部分组成:
- 高压电源
- 真空系统
- 显微镜列
- 探测器(例如，成像相机，光谱仪)
- 控制计算机和软件
加速电压
是施加在电子枪上的电场势，以加速电子束通过显微镜柱并最终到达样品。更高的加速电压对应更小的电子波长和更高的分辨率。
在柱子的顶部是电子枪，它与一个高压电源用于设置电子束的动能。典型的加速电压范围从80千伏到300千伏。的显微镜列由一系列电磁透镜和光圈组成，用于将电子束聚焦到样品上，并将TEM图像放大到观察屏幕(或探测器)上。一个真空系统用于在整个色谱柱中保持所需的真空水平。由于仪器的复杂性，大多数组件都是如此自动计算机控制只有几个关键参数由显微镜师控制。用户控制的主要设置包括样品级位置，放大倍率，物镜电流，光束电流(光斑大小)，以及在获取数据时使用的光圈和探测器的选择。
现代tem配备了电子设备探测器(如电荷耦合器件，或CCD，探测器)，除了可伸缩的荧光观察屏幕，以数字格式捕获TEM图像。大多数tem还将包括一个x射线探测器，可以插入物镜极片之间(靠近样品)，以分析成分。可选的电子能量损失光谱仪位于柱的末端用于电子能量损失谱(EELS)。
真空系统
为了消除电子束与除样品外的任何东西的相互作用，高真空系统连接到柱[2]。典型的TEMs将采用三种类型的真空泵:
- 粗加工泵从大气压降至“低”真空水平(约0.01毫巴)。这些泵的声音非常大，因为它们是机械地抽吸相对大量的空气。粗加工泵通常在一段时间内多次使用，在试样进入柱的超高真空环境之前，将试样负载锁定室泵出。粗加工泵也用于“背”某些高真空泵，提供额外的泵层。
- 一种或多种类型的高真空泵，需要粗泵“支持”以达到超高真空水平(即105到10－10mbar)。例如涡轮泵或扩散泵。这些泵是用来泵下柱子的。一旦色谱柱达到所需的真空水平，通常关闭背压泵或粗加工泵，以减少机械振动，并在短时间内每隔几小时自动触发泵出积聚的气体。
- 一个或多个不需要底座的高真空泵，如离子泵。离子泵用于维持枪膛内的超高真空。差动泵孔用于将离子泵泵出的枪腔与柱的其余部分分离，以保护电子枪不退化。
一些tem将有额外类型的泵，分别用于高真空和低真空范围，称为“吸力器”或“陷阱”。它们允许某些气体吸附在化学反应表面上。像“冷手指”这样的低温泵通常位于物镜极片内(即在样品附近)，以将杂散气体分子冻结到其表面。显微镜柱外的小液氮杜瓦瓶在会议开始时被填充(有时在会议期间被填充)以保持性能。
压力和真空
除非对TEM进行维护或维修，否则TEM需要永久保持在真空下。样品通过气锁系统插入和取出，该系统从大气(~ 105Pa)降到~105爸爸在几分钟内就死了——真是不可思议!
电子枪
TEM最重要的部分之一是电子源，通常被称为电子“枪”。电子源需要满足一定的要求才能产生高分辨率的图像。用于TEM的电子枪主要有两种类型:热离子电子枪和场发射电子枪。发射器的特性将决定显微镜的分辨率极限，这取决于亮度(即源的单位立体角电流密度)，空间相干性和时间相干性。
热离子枪含有一根灯丝，灯丝可以是由急剧弯曲的钨丝或陶瓷晶体(例如，LaB6或CeB6)末端有尖头的晶体。电流通过灯丝加热尖端并发射电子。
热离子发射器连接到一个杯状电极上，电极顶端下方有一个小洞。这种装置也被称为Wehnelt柱体，它有助于定位发射的电子，并产生可以被照明系统进一步操纵的聚焦光束。
连贯还是不连贯?
电子的波动性质意味着从枪中发射的单个电子可以是相干的，也可以是非相干的。理想的情况是由相互“步调一致”的电子组成的完美相干束流。偏离这一理想状态可以用空间和时间相干性来描述，这将最终决定分辨率极限[3]。
时间相干长度:λc＝v h/ΔE
ν =电子速度，h = Plack常数，ΔE =束流的能量扩散
空间相干长度:dc＝λ/2α
λ=电子波长(即加速电压)，α =源对样品的夹角(可通过电容器孔径进行修改)
与钨相比，陶瓷晶体可以在较低的温度下发射电子，从而产生更亮的光束(即更高的电流密度)，能量扩散更少(即更好的时间相干性)。它们比钨更贵，需要更高的真空水平，但支持更长的寿命和更好的空间分辨率。
场发射枪(FEGs)依靠一种不同但更简单的机制来发射电子，即隧穿。电场通过第一阳极(阳极1)施加到由钨制成的极其尖锐的尖端，以诱导隧穿。第二个阳极(阳极2)将电子加速到指定的加速电压。不需要Wehnelt圆柱，因为两个阳极一起作用聚焦光束。其结果是比任何热离子发射器都更明亮和相干的光束，使其成为高分辨率S/TEM应用的理想选择。
两种类型的FEG源是冷FEG和肖特基FEG。冷FEG完全依赖于隧穿产生电子，而肖特基型FEG则由热离子发射辅助。这是通过在钨尖端涂上一层薄薄的氧化锆(ZrO)来实现的，这降低了功函数，从而促进了电子的热辐射。
电子枪[3]特性比较
| 交叉尺寸(nm) | 亮度(a / m2sr) | 能量分布在100千伏(eV) | 发射电流稳定性(%/h) | 一生(人力资源) | |
| 钨(热离子) | ＞105 | 1010 | 3. | ＜1 | One hundred. |
| 实验室6 | 104 | 5 × 1011 | 1．5 | ＜1 | 1000 |
| 肖特基FEG | 15 | 5 × 1012 | 0.7 | ＜1 | > 5000 |
| 冷FEG | 3. | 1013 | 0.3 | 5 | > 5000 |
照明系统
照明系统从电子枪中获取光束，并将其引导到样品上，其形式可以是用于TEM的宽“平行”光束，也可以是用于STEM的小型聚焦探头。要做到这一点，需要两个聚光镜的组合，并且在第二个聚光镜的出口平面上至少有一个孔径(结合倾斜和偏转线圈)。
在透射电镜模式下，聚光镜经过调整，在样品上形成直径为几微米的宽光束[3]。物镜的上极片可以作为第三个聚光镜来产生更加平行的光束。这是理想的产生尖锐的衍射模式和更强的图像对比度。
对于STEM模式，则需要相反的情况。相反，照明系统的作用是在样品入口表面形成一个汇聚光束(探头)。通过扫描聚焦探头在视场上形成图像。电容器孔径被插入来定义探头的收敛角，α。
电磁透镜
电磁透镜主要由两部分组成:铜线线圈和极片。电流通过线圈在柱内产生磁场。磁场是不对称的:中心最弱，边缘最强，这有助于聚焦离轴电子并形成交叉光束。
物镜
透射电镜中最重要的透镜是物镜。它形成的图像和衍射图案(DPs)被放大到观看屏幕或相机上。
与光学光学类似，图像的特征是图像中的点与物体中的点之间的一对一对应关系。在TEM图像的情况下，物体是在样品的出口表面传输的电子。物镜在后焦平面(BFP)中分散从样品出口一侧出现的电子，在那里发现衍射图案，并在像平面中重新组合它们。为了生成原子柱的高分辨率图像，物镜的焦距必须最小化以最大化放大。因此，物体距离，或标本和物镜之间的距离必须非常小。
由于这些特殊的要求，物镜的构造比柱中的其他透镜更为复杂。所谓的“分裂”结构允许单独的线圈组来独立控制上、下极片的场强。这种几何形状不仅为在极片间隙内插入靠近物镜的样品提供了空间，从而使物体距离最小化，而且它还适合插入x射线光谱仪以及各种样品夹(例如，双倾斜，原位，冷却等)。
分离设计也有利于TEM和STEM模式之间的切换。上极片电流可独立调节，形成STEM模式下的收敛探头。在TEM模式下，下物镜极片负责成像(上物镜极片辅助平行光束形成)。
重要的是要注意物镜应该在恒定电流下工作，以使镜头像差最小化。因此，通过测角仪调整标本的“z -高度”来实现聚焦。一个称为正心平面的术语被用来定义物镜的标准物平面。当试样高度在正心平面时，图像将被聚焦，物镜将有一个标准参考值。
镜头像差和实际分辨率
在TEM模式下，实际分辨率由物镜形成物体图像的能力决定。在STEM模式下，分辨率取决于汇聚探针的大小和亮度。无论哪种情况，镜头像差(即不完美)都会限制分辨率。
中间镜头和投影仪镜头
中间镜头和投影镜头将图像或衍射图案放大到观看屏幕上。多个中间透镜用于调节物镜产生的图像或DP的放大程度。投影仪镜头是将图像/DP投影到观看屏幕或相机上的最后一个镜头。
Electron-Sample交互
为了确定正确的成像方法或正确解释图像对比度或光谱特征，理解源自TEM的所有相关信号非常重要。瞬变电磁法中产生的所有信号都来自弹性散射或非弹性散射。
弹性散射
弹性散射事件不涉及能量转移到入射电子。与孤立原子的两种相互作用导致弹性散射:
- 与电子云的相互作用导致低角度散射。
- 对带正电的原子核的库仑吸引导致高角度(卢瑟福)散射。
在真实的TEM样品中(通常是晶体材料)，原子以可重复的3D排列(晶格结构)排列。当电子束进入晶体时，弹性散射将以与该材料中独特的晶格间距(也称为d间距)对应的特征角度发生。这些特征散射角也被称为布拉格角。因此，衍射图样捕捉布拉格角的印记，并传达有关材料晶体结构的信息，如对称性、晶格间距、应变和缺陷。对于多晶或非晶材料，衍射模式为一系列弥散环，其中环半径与晶格间距相对应，且弥散度大小随平均晶粒尺寸的减小而增大。
振幅对比TEM图像
透射电子(波)的振幅可以通过两种机制改变:
- 样品在视野中的质量厚度变化。
- 衍射(布拉格)条件下的不均匀性。
样品质量或厚度的变化(或两者都有)将改变通过卢瑟福(热扩散)散射传输样品的电子振幅。这种类型的散射发生在大角度。因此，通过在直接光束(光轴)周围放置物镜孔径，这些高角度散射电子被排除在像面之外，从而形成一个亮场(BF)像。BF图像显示了质量厚度的对比，因此质量厚度较高的区域是黑色的。
衍射对比图像是通过排除所有电子产生的，除了那些散射到特定布拉格角的电子。物镜孔径被放置在一个选定的布拉格光束(晶格间距)，结果在一个暗场(DF)图像。振幅对比发生时，衍射条件的一个特定的布拉格角改变了视野。因此，通过DF对比可以推断出晶体取向的轻微变化(即Bragg条件)。在实践中，获得DF图像的最佳方法是将样品倾斜到所谓的“双光束”条件，其中直接光束和只有一个布拉格光束被强烈激发。
相位对比TEM图像
当多个光束，如直接光束和布拉格光束，由于相对相移而发生建设性和破坏性干涉时，就会发生相位对比。这种现象产生了在HR-TEM图像中观察到的晶格条纹、样品边缘的菲涅耳条纹或Moiré图案。相位对比图像产生了最高的空间分辨率，因为多束，那些分散到更高的角度(较小的d间距)。
解读相位对比图像
虽然相位对比图像是获取原子分辨率TEM图像的一种方法，但如果没有极薄的样本，它们可能特别难以解释。这是因为相位对比对样品厚度、样品倾斜、焦点和透镜像差的变化很敏感。如果样品很薄且电子-光学参数已知，则可以将图像模拟用于结构解释。
选定区域衍射
TEM中另一个有用的模式是使用选定区域孔径来生成选定区域衍射(SAD)图案。这是收集高质量衍射图案的最有用的方法，因为样品可能会在整个视野中弯曲，导致DP失真。由于SAD孔径位于物镜的像平面上，插入SAD孔径允许显微镜只包括由SAD孔直径定义的局部区域的电子。
高角度环形暗场(HAADF) STEM图像
在STEM模式下，可以使用高角度环形暗场(HAADF)检测器生成原子分辨率的质量厚度对比度图像。该探测器收集被喷射到高散射角度的卢瑟福散射电子。当收敛探针扫描视场时，HAADF探测器收集每个点的信号强度，并有效地映射原子列位置。
非弹性散射
与弹性散射不同，非弹性散射的特点是入射电子的可测量的能量损失-在meV (1000 meV = 1 eV)到几百eV，这只代表入射光束能量的一小部分。
瞬变电磁法中有许多类型的信号是由非弹性散射引起的。将这些数据与高分辨率图像相匹配，可以提供只有S/TEM才能提供的强大的相关数据。现代S/TEM提供的这种材料表征的“整体”方法(即对成分、化学和键合进行分析纳米分析的能力)使得该技术在纳米技术和材料科学应用中如此有用。
非弹性散射产生能量损失电子、x射线发射、二次电子发射，有时也产生可见光发射(即阴极发光或CL)。TEM分析中最常用的两种非弹性信号是通过电子能量损失能谱(EELS)测量的能量损失电子和通过能量色散x射线能谱(即EDS或EDX能谱)检测的特征x射线。
x射线光谱
x射线光谱学是可以在TEM或STEM中进行的最流行的化学分析之一。EDX光谱提供了样品中存在元素的快照。通过非弹性散射产生的x射线有两种:
- 特征x射线:用于缺陷、表面、沉淀物和界面等纳米级区域的成分分析。
- 轫致辐射x射线:从德语翻译为“制动辐射”是一种连续x射线发射，涉及与原子核的非弹性相互作用。它通常用于生物应用。
当入射电子穿透到内壳层电子时，就会产生特征x射线。如果有足够的能量从入射电子转移到内壳层电子，那么样品中的原子就会被电离。这种激发态包括一个“洞”被留在内层。为了使原子放松到基态，它必须通过发射与内层和外层之间的能量差相同的能量的x射线来用一个外层电子填充空穴。因为每个元素在每个电子壳层内都有独特的能级，特征x射线是样品组成的代表。
当快速电子穿透所有电子壳层并与原子核电荷场发生非弹性相互作用时，就会发生轫致辐射x射线。与特征x射线不同的是，这种相互作用造成的能量损失可以是任何低于入射光束动能上限的能量。在EDX光谱中，特征x射线叠加在这个连续信号上。对于生物学家来说，轫致辐射强度对于理解标本的平均原子序数是有用的。在材料科学应用中，轫致辐射通常被认为是掩盖特征x射线的背景信号。
从薄试样发射的特征x射线是各向同性的。另一方面，轫致辐射在前进方向上是各向异性的(即，集中在试样的出口表面一侧)。这一事实可以用来增强元素分析的信号强度。EDX探测器被插入极片间隙之间(样品上方)，样品向EDX探测器倾斜进一步有助于提高信噪比。
电子能量损失能谱
EELS测量了在样品[4]中发生非弹性相互作用的所有电子的能量分布。不像x射线光谱学，检测去激发事件，EEL光谱代表激因此，与EDX光谱学相比，它可以探测更广泛的现象。这些包括核壳跃迁，等离子体共振，半导体中的价带到导带跃迁，甚至振动模式(声子)。
镜头畸变
由于各种原因，透射电镜衍射极限分辨率远远优于实际分辨率。这些可能包括显微镜室的机械振动、声学干扰、不稳定的高压源和厚样品——所有这些都降低了实际分辨率。一旦克服了这些障碍(在先进的TEM设备中这是一个相对容易的过程)，物镜像差的现实将最终限制显微镜的分辨率。限制显微镜分辨率的物镜像差的两种主要类型是球形像差和色差。
球面像差
球差，通常称为“C年代为球面像差系数，存在于所有圆形的电磁透镜中(物镜被认为是一个“圆形”透镜)。它对离轴电子射线的影响是，离轴电子射线被样品散射得越远，聚焦的强度就越大。因此，在TEM图像中，源自物体的点呈现为有限的圆盘(即扭曲或模糊)。考虑到这一点，可以通过将物镜电流调整到稍微“散焦”的条件来实现最佳分辨率，这意味着中间镜头的物体不在像平面上，而是稍微“高于”这个平面。这种情况称为舍尔泽离焦[5]。
球差校正器在用于原子分辨率成像的先进S/TEM仪器上很常见。这些补偿有限的球像差展开离轴光束，使他们收敛到一个点，而不是一个圆盘在像平面。
C的另一个有用的方面年代-校正tem是调整球差系数的可能性。被称为负Cs成像(NCSI)的方法已被用于增强轻元素(如氧原子)的对比度，以帮助解释金属氧化物[6]中的结构缺陷。
色差
色差(Cc)与电子的能量(波长，即颜色——作为可见光的类比)有关，而电子并不像加速电压所暗示的那样是单色的。根据电子枪的类型，束流的能量分布将从约0.3 eV(冷FEG)到约1 eV (LaB)不等6热离子)[3]。在传统的S/ tem中，色差不会限制空间分辨率，因为相对能量扩散只是加速电压的一小部分。然而，在配备C年代校正器，下一个限制实际分辨率的东西是色差。
色差产生的另一种方式是由于厚试样内的非弹性散射。这就产生了能量损失电子，并进一步增加了存在于样品中的光束的能量扩散。这种影响随着样品厚度的增加而加剧，这也是为什么极薄样品(<100 nm)更适合用于高分辨率成像和纳米分析的另一个原因。
有两种方法来减少色差。第一种也是最直接的方法是限制试样厚度。另一种最小化色差的方法是通过光束单色仪，它可以将能量传播降低到几meV，这大约是冷FEG枪能量传播的100倍。在STEM-EELS中使用单色器使显微镜学家能够检测晶体和其他材料中的声子或振动模式，具有纳米空间分辨率[7]。
透射电子显微镜的优点和局限性
虽然TEM是一种非常通用的技术，具有广泛的应用，但重要的是要注意TEM的局限性，除了注意它的许多优点之外。通过了解TEM和STEM的潜在缺点，显微镜学家不仅可以更好地理解这些仪器产生的复杂数据，而且还可以开发出解决某些局限性的新方法，从而扩大该技术的实用性。
优势
- 提供最高和最强大的放大率的任何显微镜技术。
- 多功能成像模式:暗/亮场和相位对比(TEM);高角度环形暗场(STEM)。
- 提供了通过使用选定区域衍射(SAD)从纳米尺寸区域收集电子衍射模式(晶体学信息)的能力。
- 支持纳米分析:能够收集有关成分和结合的局部信息，可以与高分辨率图像相关联。
缺点
- 采样有限:HR-TEM图像的典型视场不超过100 nm2．
- 复杂图像解译:所有TEM图像(和衍射模式)都是3D结构的2D投影。
- 电子束损伤的可能性，特别是对轻元素，生物样品和软材料。在许多情况下，这使得在样本非定形之前收集有意义的数据具有挑战性。
- 利用低温透射电镜、低剂量透射电镜、低千伏透射电镜等先进设备的专业技术可以用来分析光束敏感材料。
- 要求真空环境-限制了在实际“工作”条件下观察功能材料的能力。
- e -TEM和原位TEM支架可用于在刺激(热、气、液、电偏压)下探测材料。
- 难以制备极薄的样品;薄样品经常导致成像伪影。
参考文献
[1] Wrapp，王楠，柯贝特，j.a. Goldsmith, c.l。Hsieh, O. Abiona, B. S. Graham和J. S. Mclellan，“2019-nCoV在预融合构象中的峰值的Cryo-EM结构”，科学，第367卷，no. 1。6483，第1260-1263页，2020。
[2] J. Rodenburg，“真空系统”[在线]。可用:http://www.rodenburg.org/guide/t1400.html。[2022年8月访问]。
D. B. Williams和C. B. Carter，透射电子显微镜，施普林格，2009。
R. Egerton，电子显微镜中的电子能量损失谱学，纽约:施普林格，1996。
[5] O. Scherzer，“电子显微镜的理论分辨率极限”，应用物理学报，第20卷，no. 1。20日,1949年。
贾春春，侯本，A. Thust, J. Barthel，“负球差成像技术在定量HRTEM中的应用”，中国显微工程杂志，vol. 11, no. 1。5, pp. 500-505, 2010。
O.克里瓦内克，T.洛夫乔伊，…Dellby, T. Aoki, R. Carpenter, P. Rez, E. Soignard, J. Zhu, P. Batson, M. Lagos, R. Egerton和P. Crozier，“电子显微镜中的振动光谱学”，自然，第514卷，第209-214页，2014。
[8] L. Ruiz-Perez, G. Marchello, C. D. Pace, S. Acosta-Gutierrez, G. Ing, N. Wilkinson, F. Gervasio, G. Battaglia, F. Werner和S. Pilotto，“液态水中的蛋白质构象空间成像”，BioRxiv, 2021。
[9] R. B. G. Ravelli, F. J. T. nijpel, R. J. M. Henderikx, G. Weissenberger, S. Thewessem, A. Gijsbers, B. W. A. M. M. Beulen, C. López-Iglesias和P. J. Peters，“使用针印和喷射玻璃化的亚nl卷的Cryo-EM结构”，自然通讯，第11卷，no. 1。2563，第1-9页，2020。